قلمههای ریشهدار شده انگور، بعد از استقرار در گلدان، با محلول غذایی هوگلند آبیاری شده و پس از گذشت ۱۰۰ روز از کاشت قلمههای ریشهدار شده در گلدانها، تیمارهای شوری، اعمال شد. نمک مورد استفاده برای تنش شوری، کلرید سدیم بود. این نمک همراه با محلول غذایی هوگلند، مورد استفاده قرار گرفت. غلظتهای کلرید سدیم مورد استفاده شامل ۰ (شاهد)، ۲۵، ۵۰، ۷۵ و ۱۰۰ میلیمولار بودند. گیاهان شاهد، فقط محلول غذایی نیم غلظت هوگلند (بدون نمک) دریافت نمودند. هدایت الکتریکی (EC) نمکهای مورد استفاده در دمای ۲۵ درجه سلسیوس، به ترتیب ۴/۱، ۶/۳، ۵/۷ و ۸/۱۱ دسیزیمنس بر متر بود.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
برای جلوگیری از ایجاد شوک ناشی از تنش شوری به گیاهان، در اولین آبیاری بعد از شروع تنش شوری، از نمک ۲۵ میلی مولار همراه با محلول غذایی هوگلند استفاده شد، در آبیاری دوم از نمکهای ۲۵ و ۵۰ میلی مولار، در آبیاری سوم از نمکهای ۲۵، ۵۰ و ۷۵ میلی مولار و نهایتا از آبیاری چهارم به بعد، از نمک های ۲۵، ۵۰، ۷۵ و ۱۰۰ میلی مولار در محلول غذایی استفاده شد. هفته ای یک بار، شتشوی کامل محیط ریشه گیاهان با آب مقطر انجام گرفت تا تغییرات EC و pH ناشی از تجمع نمکها در بستر کاشت در اثر انجام عمل آبشویی به کم ترین حد ممکن برسد. آبیاری این گیاهان به صورت یک روز در میان با محلول نیم غلظت هوگلند تا پایان دوره آزمایش انجام شد. لازم به ذکر است که تیمارهای شوری به مدت هفت هفته (۴۹ روز) ادامه یافت (Sivritepe et al., ۲۰۱۰ ; Melgar et al., ۲۰۰۸).
۳-۶- کاربرد سدیم نیتروپروسید (SNP)
سدیم نیترو پروسید (SNP) به عنوان ماده تولید کننده نیتریک اکسید، به صورت محلول پاشی روی برگهای انگور، در چهار غلظت ۰ (شاهد)، ۵/۰، ۱ و ۵/۱ میلی مولار به کار رفت. نحوه تهیه محلول سدیم نیترو پروسید به این ترتیب بود که مقادیر نامبرده این ماده را جداگانه وزن نموده، سپس آنها را در آب مقطر ریخته و برای حل شدن بهتر، روی دستگاه Hot Plate به مدت بیست دقیقه قرار میدهیم. گیاهان شاهد فقط با آب دیونیزه، محلول پاشی شده و محلول غذایی هوگلند بدون نمک دریافت نمودند. برای افزایش سطح چسبندگی محلول سدیم نیترو پروسید، از توین ۲۰ استفاده شد. تیمارهای سدیم نیترو پروسید، در ۴ مرحله (در زمان تیمار شوری و مراحل بعدی، ۲، ۴ و ۶ هفته بعد) روی برگ ها محلول پاشی شدند.
۳-۷- کاربرد اسید سالیسیلیک
اسید سالیسیلیک نیز به صورت محلولپاشی روی برگهای انگور، در چهار غلظت ۰ (شاهد)، ۱۰۰، ۲۰۰ و ۳۰۰ میلی گرم در لیتر اعمال گردید. نحوه تهیه محلول اسید سالیسیلیک به این ترتیب بود که مقادیر نامبرده این ماده را جداگانه وزن نموده، سپس آنها را در آب مقطر ریخته و برای حل نمودن بهتر، روی دستگاه Hot Plate به مدت نیم ساعت قرار می دهیم. نکته مهم در تهیه این محلول، تنظیمpH است ( در ابتدا pH محلول بین ۵/۲ تا ۳ است). با اضافه نمودن چند قطره هیدروکسید پتاسیم یک نرمال، pH محلول را برروی ۶ تنظیم می نماییم. گیاهان شاهد، فقط با آب دیونیزه محلولپاشی شده و محلول غذایی هوگلند بدون نمک دریافت نمودند. تیمارهای اسید سالیسیلیک نیز در ۴ مرحله (در زمان شروع تیمار شوری و مراحل بعدی ۲، ۴ و ۶ هفته بعد) روی برگها محلول پاشی شدند.
۳-۸- صفات مورد بررسی و روشهای اندازه گیری آنها
۳-۸-۱- ویژگیهای رشدی گیاه
به منظور بررسی اثر تنش شوری بر برخی از ویژگیهای رویشی گیاهان مورد آزمایش، در پایان آزمایش، صفاتی نظیر ارتفاع بوته و طول ریشه توسط خط کش، قطر ساقه (قطر شاخساره حاصل از رشد) توسط کولیس دیجیتال (No:Z, Model 22855)، سطح برگ توسط دستگاه اندازه گیری سطح برگ (Leaf Area Meter, AM 200) و وزن تر برگ، وزن تر شاخساره و ریشه به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم) اندازه گیری گردید. همچنین تعداد برگها شمارش شد. جهت تعیین وزن خشک نمونهها (برگ، شاخساره و ریشه)، ابتدا نمونهها به مدت ۷۲ ساعت در آون با دمای ۷۰ درجه سلسیوس قرار گرفتند و پس از خارج نمودن نمونهها از آون، وزن خشک آن ها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم) تعیین شدند.
۳-۸-۲- اندازه گیری نشت یونی غشاء برگ
روش کار بدین صورت بود که از هر تکرار، تعداد دو برگ توسعه یافته از قسمت انتهایی ساقه، نمونه گیری و به قطعههای ۱×۱ سانتی متر تقسیم شدند. قطعهها ۳ بار با آب مقطر شسته شده و در لولههای آزمایش ۱۰ میلی لیتری محتوی آب مقطر نگهداری شده، سپس به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق (۲۵ درجه سلسیوس)، در دستگاه شیکر قرار گرفته و EC1 خوانده شد. سپس همان نمونهها در اتوکلاو در دمای ۱۲۰ درجه سلسیوس به مدت ۲۰ دقیقه قرار گرفته و بعد از خنک شدن محلول و رسیدن دمای آنها به ۲۵ درجه سلسیوس، EC2 نیز قرائت شد. نشت یونی غشاء برگ به صورت درصد با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد (Luttes et al., ۱۹۹۵).
[EC1/EC2]×۱۰۰ = نشت یونی غشاء برگ (٪)
۳-۸-۳- محتوای نسبی آب برگ(RWC)
برای اندازه گیری محتوای نسبی آب برگ، ابتدا در هر بوته، ۱۰ عدد دیسک برگی به قطر ۸ میلی متر از برگهای توسعه یافته قسمت انتهایی ساقه تهیه شد. بلافاصله وزن تر آنها به کمک ترازوی دیجیتالی (با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم) اندازه گیری گردید و سپس در داخل ظروف پتری دیش حاوی آب مقطر به مدت ۴ ساعت در یخچال (۴ درجه سلسیوس) و در تاریکی قرار داده شدند. پس از خارج کردن دیسکها از آب مقطر، جهت حذف رطوبت اضافی سطح دیسک ها، آنها را در بین دو لایه کاغذ صافی خشک نموده و سپس وزن آماس آنها اندازه گیری شد، سپس به مدت ۲۴ ساعت دیسک های برگی را به آون (۷۰ درجه سلسیوس) منتقل نموده و وزن خشک آنها تعیین گردید و در نهایت محتوای نسبی آب برگ با بهره گرفتن از رابطه زیر محاسبه شد (Turner, 1981).
۱۰۰×[(وزن خشک-وزن آماس)/(وزن خشک-وزن تر)]=محتوای نسبی آب برگ (درصد)
۳-۸-۴- میزان پرولین آزاد
برای اندازه گیری پرولین ابتدا نیم گرم از بافت تازه برگی (برگهای توسعه یافته انتهایی) به همراه ۵ میلی لیتر اتانول ۹۵ درصد در داخل هاون چینی کوبیده و له شد. قسمت بالایی محلول حاصله، جدا گشته و رسوبات آن دوباره با پنج میلی لیتر اتانول ۷۰ درصد شستشو شده و فاز بالایی آن به قسمت رویی قبلی اضافه گردید. محلول بهدست آمده، به مدت ۱۰ دقیقه در ۳۵۰۰ دور سانتریفیوژ شد. سپس فاز مایع رویی برداشته شده و عصاره الکلی به دست آمده تا زمان اندازه گیری پرولین و قندهای محلول در داخل یخچال (۴ درجه سلسیوس) نگهداری گردید (Irigoyen et al., ۱۹۹۲).
برای تعیین غلظت پرولین، یک میلی لیتر از عصاره الکلی تهیه شده را با ۱۰ میلی لیتر آب مقطر رقیق نموده و ۵ میلی لیتر معرف نین هیدرین[۱۹]به آن اضافه شد (روش تهیه نین هیدرین به ازاء هر نمونه: ۱۲۵/۰ گرم نین هیدرین + ۲ میلی لیتر اسید فسفریک ۶ مولار + ۳ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال). پس از افزودن ۵ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال به آن و هم زدن دستی به مدت چند ثانیه، محلول حاصله به مدت ۴۵ دقیقه در حمام آب گرم (۱۰۰ درجه سلسیوس) قرار داده شد. پس از در آوردن نمونه ها از حمام آب گرم و خنک شدن آن ها، ۱۰ میلی لیتر بنزن به هر کدام از نمونه ها افزوده شده و به شدت تکان داده شد تا پرولین وارد فاز بنزن گردد. نمونهها به مدت ۳۰ دقیقه به حال سکون رها شدند. استانداردهایی از آلپرولین از غلظت صفر تا ۱/۰ میکرومول بر میلی لیتر تهیه گردید و نهایتا میزان جذب محلول های استاندارد و نمونه ها در طول موج ۵۱۵ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (Paquin and Lechasseur, 1979).
۳-۸-۵- میزان قندهای محلول کل
برای اندازه گیری قندهای محلول، ۱/۰ میلی لیتر از عصاره الکلی نگهداری شده در یخچال، به کمک میکروپیپت به داخل لوله آزمایش ریخته شده و ۳ میلی لیتر آنترون[۲۰] تازه تهیه شده (۱۵۰ میلی گرم آنترون + ۱۰۰ میلی لیتر اسید سولفوریک ۷۲ درصد، W/W) به آن افزوده شد. لولههای آزمایش به مدت ۱۰ دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد تا ماده رنگی تشکیل گردد. پس از خنک شدن نمونهها، میزان جذب آنها در طول موج ۶۲۵ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای تهیه استاندارد قند، از گلوکز، محلولهایی با غلظت های صفر تا ۱۲۰میلی گرم در لیتر تهیه و کلیه مراحل آزمایش روی آنها انجام گردید و نهایتا میزان جذب آنها در طول موج ۶۲۵ نانومتر قرائت گردید (Irigoyen et al., ۱۹۹۲).
۳-۸-۶- اندازه گیری محتوای مالون دی آلدئید (MDA)
اندازه گیری محتوای مالوندیآلدئید که شاخص پراکسیداسیون لیپیدی در طی تنشها و همچنین معیاری برای سنجش تاثیر تنش میباشد، با بهره گرفتن از روش Popham and Novachy (1991) اندازه گیری شد. در این روش ۲/۰ گرم بافت تر گیاهی (برگ) در ۵ میلی لیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 1 درصد ساییده شده و داخل لوله آزمایش ریخته شد. سپس نمونه ها به مدت ۱۰ دقیقه در دور g 8000 سانتریفیوژ شدند. ۱ میلی لیتر از فاز بالایی نمونههای سانتریفیوژ شده، در لولههای آزمایش که حاوی ۴ میلی لیتر محلول ۲۰ درصد تری کلرو استیک اسید در ۵/۰ درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) بودند، ریخته شد. نمونهها به مدت ۳۰ دقیقه در بن ماری با دمای ۹۵ درجه سلسیوس قرار گرفته و بی درنگ در آب یخ سرد شدند. سپس به مدت ۵ دقیقه در دور g 8000 سانتریفیوژ شده و در نهایت جذب آن در ۵۳۲ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد. میزان مالون دیآلدئید با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه گردید.
MDA (µmol/g FW)= [A532-A600/155]×۱۰۰۰
۳-۸-۷- اندازه گیری رنگیزههای کلروفیل و کاروتنوئید
برای اندازه گیری رنگیزههای کلروفیل و کاروتنوئید، از روش Lichtenthaler and Wellburn (1985) استفاده شد. ۱/۰ گرم از وزن تر برگ به همراه ۵ میلی لیتر استون ۸۰ درصد در هاون چینی ساییده شد. عصاره حاصل به مدت ۱۰ دقیقه در ۲۵۰۰ دور، سانتریفیوژ شد. سپس جذب فاز بالایی هر یک از نمونههای سانتریفیوژ شده توسط اسپکتروفتومتر در طول موجهای ۶۶۲ نانومتر، ۶۴۵ نانومتر و ۴۷۰ نانومتر اندازه گیری شد. برای محاسبه کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید از فرمولهای زیر استفاده شد:
Chl a = 11.75 A662 – ۲٫۳۵۰ A645
Chl b = 18.61 A645 – ۳٫۹۶۰ A662
Car =1000 A470 – ۲٫۲۷۰ Chl a- 81.4 Chl b /227
در این رابطه Chl a، Chl b و Car به ترتیب غلظت کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید می باشد (A میزان جذب خوانده شده در هر طول موج توسط اسپکتروفتومتر میباشد).
۳-۸-۸- اندازه گیری گلایسین بتائین
برای اندازه گیری گلایسین بتائین از روش Greive and Grattan (1983) استفاده گردید. ابتدا نمونههای گیاهی را در دمای ۸۰ درجه به مدت ۷۲ ساعت خشک نموده ۵/۰ گرم از برگ را توزین کرده و آن را در ارلن ریخته و ۲۰ میلی لیتر آب دیونیزه به آن اضافه گردید و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه سلسیوس روی شیکر قرار داده شد. سپس نمونهها از کاغذ صافی عبور داده شدند.
پس از تهیه اسید سولفوریک ۲ نرمال (۲N)، ۱ میلیلیتر از عصاره گیاهی را با ۱ میلی لیتر اسید، مخلوط (به نسبت ۱:۱) و سپس مقدار ۵/۰ میلی لیتر از ترکیب حاصله را در لوله آزمایش ریخته و در حمام آب یخ به مدت ۱ ساعت قرار داده و نهایتا پس از تهیه مخلوط ید و یدید پتاسیم (۷/۱۵ گرم ید خالص به علاوه ۲۰ گرم یدید پتاسیم) مقدار ۲/۰ میلیلیتر از یدید پتاسیم و ید را به لوله آزمایش اضافه کرده و آن را ورتکس می نمائیم. در این مرحله نمونهها به مدت ۱۶ ساعت در دمای صفر تا ۴ درجه سلسیوس نگهداری گردیدند. بعد از آن نمونهها به مدت ۱۵ دقیقه در دمای صفر درجه سلسیوس با میزان دور ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در هر لوله آزمایش، فاز محلول رویی جدا و فقط کریستال موجود در کف لوله نگه داشته شد. این مراحل حتما بایستی در محیط حمام آب یخ انجام شود تا خطای آزمایش کاهش یابد. سپس کریستالهای موجود را در ۹ میلی لیتر از محلول ۱ و ۲ دی کلرو اتان حل کرده و پس از عمل ورتکس و طی زمان ۲ ساعت، مقدار جذب آن در طول موج nm 365 اندازه گیری شد.
۳-۸-۹- اندازه گیری پروتئین کل
برای تعیین میزان پروتئین محلول کل از روش برادفورد استفاده شد. برای این منظور ۱۰۰ میلی گرم کومایسی بلو را با ۵۰ میلی لیتر اتانول ۹۵ درصد حل نموده سپس با اضافه نمودن ۱۰۰ میلی لیتر اسید فسفریک ۸۵ درصد به حجم ۱ لیتر رسانیده و از کاغذ صافی عبور داده شد. برای تهیه محلول استاندارد از آلبومین سرم گاوی[۲۱] استفاده شد. در داخل سلهای یک بار مصرف ۵/۲ میلی لیتر از محلول کومایسی بلو آماده شده ریخته شد و سپس ۱۰۰ میکرولیتر عصاره برگی از هر نمونه داخل یک سل اضافه شد و نهایتا میزان جذب نمونهها و محلولهای استاندارد با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرائت شد (Bradford, 1976).
۳-۹- اندازه گیری فعالیت آنزیم ها
۳-۹-۱- استخراج عصاره گیاهی برای سنجش فعالیت آنزیم ها
برای تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز از روش Kang و Saltiveit (2001) با اندکی تغییرات استفاده شد. ۵/۰ گرم وزن تر برگ از کلیه تیمارها توزین و سپس به داخل هاون سرد منتقل شد و توسط ۳ میلی لیتر محلول بافر تریس با ۵/۷=pH (شامل اسید کلریدریک ۰۵/۰ مولار، ۳ میلی مولار کلرید منیزیم و ۱ میلیمولار EDTA) با دسته هاون خوب ساییده شد. بافر استخراجی برای اندازه گیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز شامل ۲/۰ میلیمولار آسکوربات نیز بود. هموژن حاصل به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سلسیوس با سرعت ۵۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی حاصله به عنوان عصاره خام برای اندازه گیری فعالیت آنزیم های آنتیاکسیدان مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۹-۲- اندازه گیری فعالیت کاتالاز(CAT, EC 1.11.1.6)
فعالیت آنزیم کاتالاز با بهره گرفتن از روش Aebi (1984) اندازه گیری شد. مخلوط واکنش شامل ۵/۲ میلیلیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار (۷=pH) شامل ۲/۰ میلی لیتر پراکسید هیدروژن ۱ درصد و ۳/۰ میلیلیتر عصاره استخراجی بود. سپس فعالیت آنزیم کاتالاز به صورت کاهش در جذب طی ۱ دقیقه در طول موج ۲۴۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت کاتالاز از ضریب خاموشی (mM-1 Cm-16/43) استفاده شد.
۳-۹-۳- اندازه گیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX, EC 1.11.1.1)
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در تمام تیمارها و تکرارها با بهره گرفتن از روش Nakano و Asada (1981) با اندکی تغییرات اندازه گیری شد. مخلوط واکنش شامل ۵/۲ میلی لیتر بافر فسفات ۵۰ میلیمولار (۷=pH) شامل EDTA 1/0 میلیمولار، آسکوربات سدیم ۱ میلیمولار، ۲/۰ میلیلیتر پراکسید هیدروژن ۱۰ میلیمولار و ۱/۰ میلیلیتر عصاره استخراجی بود. سپس فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به صورت کاهش در جذب طی ۱ دقیقه در طول موج ۲۹۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز از ضریب خاموشی ( mM-1 Cm-18/2) استفاده شد.
۳-۹-۴- اندازه گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX, EC 1.11.1.7)
فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز با بهره گرفتن از روش Updhyaya و همکاران (۱۹۸۵) انجام گرفت. مخلوط واکنش شامل ۵/۲ میلیلیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار (۷=pH) شامل ۱ میلیلیتر گایاکول ۱ درصد، ۱ میلیلیتر پراکسید هیدروژن ۱ درصد و ۱/۰ میلی لیتر عصاره استخراجی بود. سپس فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز به صورت افزایش در جذب طی ۱ دقیقه در طول موج ۴۲۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت گایاکول پراکسیداز از ضریب خاموشی ( mM-1 Cm-16/26) استفاده شد.
۳-۱۰- اندازه گیری عناصر برگ و ریشه
۳-۱۰-۱- استخراج عصاره گیاهی جهت اندازه گیری کلر، سدیم، پتاسیم و نیترات
فرم در حال بارگذاری ...
