در حال حاضر خرما در پنج قاره دنیا و در بیش از ۳۴ کشور کشت و مورد بهره‌برداری قرار می‌گیرد. در سال ۱۳۸۸، ایران با حدود ۲۵۳ هزار هکتار سطح زیر کشت و با تولیدی بالغ بر ۱۰۵۴۰۰ تن، از بزرگ‌ترین تولید‌کنندگان خرما در دنیا بوده است و از نظر سطح زیر کشت بعد از امارات متحده عربی و از نظر تولید بعد از کشور مصر در رتبه دوم جهانی قرار داشت (فائو، ۲۰۰۹). که از این سطح ۲۰۴۸۷۵ هکتار (۸۴ درصد) را درختان بارور و ۳۹۵۵۴ هکتار (۱۶ درصد) را درختان غیر بارور یا نهال با میانگین عملکرد ۴۹۱۲ کیلو‌گرم در هکتار تشکیل می‌دهند( آمار‌نامه وزارت جهاد کشاورزی، ۱۳۸۷).
۴-۲ گیاه‌شناسی نخل خرما
۱-۴-۲ برگ‌ها
منشأ پیدایش برگ، جوانه‌ی است که نزدیک به جوانه انتهایی که به تدریج رشد کرده برگ را تولید می‌کنند. برگ کامل از سه قسمت تشکیل یافته است: ۱- برگچه‌های که در بخش فوقانی برگ قرار دارد، ۲- قسمت خار‌دار که در بخش میانی برگ قرار دارد و ۳- قسمت عاری از تیغ یا خار که برگ را به تنه متصل می‌کند. شکل برگ پنجه‌ای یا پر مانند است. بسته به موقعیت پوشش گیاهی خرما، برگ‌های آن را می‌توان به سه دسته تقسیم کرد: ۱- برگ‌های سبز و از نظر فتوسنتزی فعال در خارج (۵۰%)، ۲- برگ‌های سبز در حال رشد در مرکز (۱۰%) و ۳- برگ‌های جوان، سفید، که از نظر فتوسنتزی هنوز فعال نیستند (۴۰%) در داخل یا قلب نخل خرما (تصویر ۲-۲).
۲-۴- ۲ اندام‌های تولید مثلی
نخل خرما گیاهی است دوپایه که گل‌های نر و ماده‌ی آن بر روی دو نخل به صورت جداگانه ظاهر می‌شوند. خوشه‌های گلدار تولید شده در محور‌های برگ سال قبل رشد کرده است. در موارد نادر هر دو گل‌های ماده و نر بر روی یک سنبله تولید شده که دو جنسه نامیده می‌شوند (میلن[۵۴]، ۱۹۱۸). گل‌های تک‌جنسی تولید کننده مادگی و پرچم، در یک خوشه بزرگ قرار دارند، که متشکل از یک ساقه مرکزی[۵۵] و چند رشته یا خوشه‌چه[۵۶] است.
گل‌های ماده که روی نخل ماده ظاهر می‌شوند، دارای پوششی مشابه و یک مادگی سه برچه‌ای است (تصویر ۱-۲ الف). گل‌های نر که روی نخل‌های نر ظاهر می‌شوند و دارای ۶ پتال (کاسبرگ و گلبرگ) و ۶ پرچم در دو ردیف قرار می‌گیرند. در مراحل اولیه آن در یک پوشش سخت احاطه شده است که به عنوان غلاف[۵۷] شناخته است. هر خوشه‌چه تعداد زیادی از گل‌های کوچک را حمل می‌کنند (چاندلر[۵۸]، ۱۹۵۸). گل‌های نر دارای شش پرچم با میله‌های کوتاه نوک تیز و برافراشته و بساک‌های متصل پشتی است، که توسط گلبرگ تخم مرغی ناقص و روپوش‌دار و سه کاسبرگ گل به صورت کاسه فنجانی سه شاخه‌ای مومی مانند احاطه شده است (تصویر ۱-۲ ب). رشد جوانه گل‌دهنده در زمستان بسیار کند بوده و در اسفند ماه شروع به رشد سریع می کند، به طوری که در اواخر زمستان (اواخر اسفند) و فروردین ماه غلاف‌ها کاملاً باز می‌شوند. تقریباً گیاهان حاصل از بذر خرما ۵۰ درصد نر و ۵۰ درصد ماده هستند.
ب
الف
ج
تصویر ۱-۲ الف- گل آذین ماده، ب-گل آذین نر، ج- سمت راست گل‌های نر و سمت چپ گل‌های ماده
۳-۴-۲ میوه
میوه‌های خرما منفرد، کشیده، استوانه‌ای نوک‌دار، تک دانه، با کلاله انتهایی است. میوه خرما سته و از دو قسمت متمایز تشکیل میشود. اول قسمت خارجی که اطراف هسته را فرا می‌گیرد و قسمت خوراکی میوه را تشکیل می‌دهد که به پریکارپ یا فرا‌بر درخت مادری است. که از سه قسمت تشکیل شده است: الف- اپی‌‌کارپ[۵۹] یا برون‌بر (پوست میوه) که عبارت است از یک پوسته نازک نسبتاً سخت و مومی و شفاف که روی هسته خرما کشیده شده است. ب- مزوکارپ[۶۰] یا میان‌بر که در زیر پوست واقع شده و قسمت گوشتی میوه و خوراکی است. ج- اندوکارپ یا درون‌بر حد فاصل بین میان‌بر (قسمت خوراکی) و دانه (هسته) است و در خرما عبارت است از یک غشا بسیار نازک و سفید رنگ که روی خرما چسبیده است. قسمت داخلی میوه که هسته نامیده میشود بسیار سخت و به رنگ خاکستری یا قهوه‌ای است. جنین خرما که کوچک و راست و فاقد ریشه چه است، در داخل آلبومن حجیم، در هسته قرار دارد (تصویر ۲-۲).
تصویر ۲-۲ نمای شماتیک درخت و میوه‌ی نخل خرما (مانیر[۶۱]، ۱۹۷۳)
۵-۲ تکثیر نخل خرما
اگر چه نخل‌ها از لحاظ اقتصادی مهم هستند، ولی بسیار نادیده گرفته شده‌اند. علاوه بر این، پیشرفت در زمینه اصلاح، ژنتیک، بهبود محصول و گسترش کشت تجاری برای نخل‌ها با عادت و طبیعت عمر طولانی این درختان تک لپه محدود بوده است. بیشتر نخل‌ها مانند، نارگیل و نخل روغنی تنها می‌توانند توسط بذر تکثیر شوند. سه روش برای تکثیر خرما وجود دارد: از طریق دانه، پاجوش (روش سنتی) و روش کشت بافت.
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۱-۵-۲ تکثیر از طریق دانه
تکثیر دانه، همان تکثیر جنسی نامیده است، که اگر چه برای اهداف اصلاحی مفید است، اما یک روش مناسب برای تکثیر رویشی نخل محسوب نمی‌شود، زیرا: ۱- نخل خرما گونه‌ای دوپایه است در نتیجه نیمی از ژنوم نتاج از پایه‌ی پدری و نیمی از پایه‌ی مادری خواهد بود، ۲- نخل خرما هتروزیگوت بوده و در نتیجه تغییرات زیادی در نتاج وجود خواهد داشت و ویژگی‌های مطلوب از والدین خود را ممکن است از دست داده باشند، ۳-گیاهچه‌های بذری از نظر پتانسیل تولید، کیفیت میوه و زمان برداشت بسیار غیر‌یکنواخت خواهند بود، بنابراین برداشت آنها برای عرضه به بازار بسیار دشوار خواهد بود.
تکثیر با بذر تا حد زیادی ساده‌ترین و سریع‌ترین روش تکثیر بوده است. با این حال، با این روش تکثیر ارقام اصیل[۶۲] تولید نمی‌کنند و هیچ دو نهالی به طور یکسان نخواهد بود. به دلیل تنوع آنها، این روش تکثیر تنها برای مقاصد اصلاحی[۶۳] مفید می‌باشد. در این صورت با کاشت دانه‌های خرما و تولید درختان متنوع می‌توان از میان آنها درختانی دارای میوه با کیفیت و دارای تحمل به تنش‌ها آنها را به صورت کلون تکثیر و معرفی کرد.
۲-۵-۲ تکثیر از طریق پاجوش
تکثیر پاجوش، یا غیر‌جنسی یا رویشی دارای مزایایی است از جمله: ۱-گیاهان پاجوشی به اصالت نخل‌های والدین می‌باشد. زیرا پاجوش از جوانه جانبی در تنه گیاه مادری توسعه یافته و در نتیجه میوه‌های تولید شده همان کیفیت نخل مادری را خواهند داشت و یکنواختی تولید را تضمین می‌کنند، ۲-گیاهان پاجوشی۲-۳ سال زودتر از گیاهچه‌های بذری میوه خواهند داد، ولی پاجوشها به طور عمده به تعداد محدودی (حداکثر۲۰ تا ۳۰) در اوایل زندگی نخل (۱۰ تا ۱۵ سال پس از کاشت خرما) تولید می‌شوند (نیکسون و همکاران[۶۴]، ۱۹۷۸) که از میان آنها در هر سال فقط سه یا چهار پاجوش برای کاشت مناسب هستند و حتی همان‌ها را باید به مدت ۱ تا ۲ سال قبل از کاشت در خزانه نگهداری و پرورش داد.
۳-۵-۲ تکثیر از طریق کشت بافت
استفاده از روش کشت بافت در خرما، که تکثیر درون شیشه‌ای نامیده میشود، دارای مزایای بسیاری است: ۱- تکثیر ارقام انتخاب شده ماده سالم (عاری از آفت و بیماری)، ارقام مقاوم به بیماری بایود[۶۵]، ارقام نر با گرده برتر با ویژگی‌های متازنیا[۶۶] مفید، ۲- تکثیر در مقیاس وسیع، ۳- تکثیر بدون تأثیر فصل، ۴- تولید گیاهان یکنواخت از نظر ژنتیکی، ۵- حصول اطمینان از مبادله آسان و سریع مواد گیاهی بین مناطق مختلف ۶- از لحاظ اقتصادی هنگامی که تولید زیاد مورد نیاز است قابل اعتماد است.
موفقیت تکثیر تک‌لپه‌ای‌ها در شرایط درون شیشه‌ای به تعداد نسبتاً کمی از گونه‌های گیاهی محدود شده است. در حالی که بسیاری از دولپه‌ی‌ها با موفقیت کشت بافت شده‌اند. به علاوه در گیاهان چوبی، توانایی باززایی گیاهچه با بهره گرفتن از تکنیک کشت بافت در مقایسه با گیاهان علفی[۶۷] پایین‌تر بوده است. در نخل‌ها، تا بیست سال پیش، موفقیت کمی در القاء و نگهداری کالوس به‌دست آمده بود. ولی امروزه تکنیک‌های کشت بافت گیاهی برای طیف گسترده‌ای از گیاهان و نخل‌های که از لحاظ اقتصادی مهم هستند به عنوان مثال، در نارگیل، نخل روغنی و خرما (کیک و همکاران[۶۸]، ۱۹۸۹) بکار گرفته شده است.
۶-۲ عوامل مؤثر بر رشد و نمو ریزنمونه
رشد و نمو گیاه در محیط درون شیشه‌ای به عوامل متعددی بستگی دارد که از آن جمله می‌توان به نوع گیاه، مواد غذایی، عوامل محیطی و مواد آلی ویژه اشاره نمود. ساختار ژنتیکی گیاه یک عوامل مهم و حساس در هر یک از مراحل رشد گیاه محسوب میشود. مواد غذایی مورد نیاز گیاه شامل آب، عناصر معدنی و قند‌ها می‌باشند. عوامل فیزیکی رشد و نمو شامل نور، درجه حرارت، pH و غلظت‌های گازهای اکسیژن و دی‌اکسید‌کربن هستند که بر جذب آب، تبخیر، فتوسنتز، تنفس، رشد و غیره مؤثر هستند. مواد آلی در غلظت بسیار کم مورد احتیاج هستند، توزیع انواع مواد به داخل گیاه و بنابراین، مسؤولیت تقسیم سلولی و رشد سلول را بر عهده دارد. تنظیم‌کننده‌های رشد، خصوصاً اکسین‌ها و سیتوکینینها، باعث تنظیم نمو اندام‌ها در ریزنمونههای کشت شده می‌گردند. تنظیم رشد و نمو یک گیاه فرایند پیچیده‌ای است که به ساختار ژنتیکی گیاه و محیط بستگی دارد. بنابراین در زمان تهیه محیط کشت بایستی اثرات متقابل این عوامل روی یکدیگر مد نظر قرار داده شود.
۱-۶-۲ محیط کشت
یکی از مهمترین عوامل دخیل در رشد، نمو و مورفوژنز بافت‌های گیاهی کشت شده مواد تشکیل‌دهنده محیط کشت می‌باشد. نیاز‌های غذایی اولیه سلول‌های گیاهی در شرایط درون شیشه‌ای شباهت زیادی با نیاز‌های غذایی گیاه کامل دارد. محیط کشت پیشنهادی توسط موراشیک و اسکوگ[۶۹] (۱۹۶۲) کاربرد وسیعی در کشت بافت دارد و به طور کلی مواد تشکیل‌دهنده آن شامل: ترکیبات غذایی که خود شامل آب، عناصر پر‌مصرف، عناصر کم‌مصرف، قند‌ها، ویتامین‌ها، اسید‌های آمینه و دیگر مواد نیتروژن‌دار، سیستم حمایت‌کننده یا عوامل ژله‌ای و مواد تنظیم‌کننده رشد گیاهی است.
در طول مراحل اولیه کشت بافت نخل خرما انواع مختلف محیط‌های غذایی توسط بسیاری از محققین از جمله محیط) WH شروئیدر، ۱۹۷۰)، محیط Knobb’s مورد استفاده قرار گرفت (آمر و بن‌بادیس[۷۰]، ۱۹۷۷). اما در حال حاضر بیشترین و با صرفه‌ترین محیط کشتی که برای کشت بافت خرما در نظر گرفته شده است محیط کشتMS موراشیک و اسکوگ است. محیط MS اولین بار در توسط کیپس و لنین– روونی[۷۱] (۱۹۷۴) در کشت بافت خرما مورد استفاده قرار گرفته است. محیط کشت پایه MS معمولاً برای جنین‌زایی و اندام‌زایی در خرما استفاده گردیده، که آن هم بسته به ژنوتیپ و رقم تغییر یافته است (جین، ۲۰۰۶). محیط کشت Y3 Eeuwens (فرناندو و گامیگی[۷۲]، ۲۰۰۰) برای کشت بساک نارگیل و همچنین محیط کشتCRI 72 )کارینه‌راتنه و پرینه‌پراما[۷۳]، ۱۹۸۹) برای کشت بافت نارگیل فرموله شده است. محیط کشت CRI 72 در القاء کالوس و جنین‌زایی سوماتیکی ریزنمونههای جنین نارس نارگیل (فرناندو و گامیگی، ۲۰۰۰)، برچه (فرناندو و همکاران، ۲۰۰۳)، تخمدان (پرارا و همکاران[۷۴]، ۲۰۰۷) با موفقیت همراه بوده است. با این حال، پاسخ مثبتی در کشت بساک نارگیل را القاء نمی‌کند (پرارا و همکاران، ۲۰۰۸). محیط کشتY3 Eeuwens در مقایسه با محیط کشت CRI 72 دارای اسید آمینه‌های (آسپاراژین، گلوتامین و آرژنین) و همچنینNH4Cl ، KCl و NiCl بالاتری است. گلوتامین اثر تحریکی بر آندروژنز دارد (گوا و همکاران[۷۵]، ۱۹۹۹). محیط کشت MS به عنوان محیط پایه برای القای آندروژنز در بسیاری از گونه‌های زراعی مانند فلفل (کیم و همکاران[۷۶]، ۲۰۰۴)؛ کدو (مت‌والی و همکاران[۷۷]، ۱۹۹۸)؛ برنج (وانگو همکاران[۷۸] ، ۱۹۸۳) و مارچوبه (پنگ و والن[۷۹] ، ۱۹۹۹) استفاده شده است. با این حال در القای آندروژنز در بساک نارگیل مؤثر نبوده است (پرارا، ۲۰۰۸).
۱-۱-۶-۲ آب
باید به کیفیت آب مورد استفاده توجه زیادی معطوف شود، زیرا قریب ۹۵ درصد از محیط کشت را آب تشکیل می‌دهد. در سال‌های اخیر، برای کشت بافت از آبی استفاده میشود که توسط اسمز معکوس[۸۰]، خالص سازی شده است. آب خالص سازی می‌تواند با بهره گرفتن از آب یون برداری[۸۱] و یا دوبار تقطیر شده[۸۲] تأمین نمود. بهتر است آب مقطر در ظروف پلی‌اتیلنی و یا ظروف شیشه‌ای پیرکس نگهداری شود، زیرا ظروف شیشه‌ای معمولی بوسیله یون‌های سرب، سدیم و آرسنیک آلوده می‌شوند که می‌توانند به آن اضافه شوند (سادات نوری و همکاران، ۱۳۹۰).
۲-۱-۶-۲ عامل ژله‌ای
کشت‌ها در شرایط آزمایشگاهی نیاز به یک سطح رشد دارند. به همین دلیل آگار به عنوان عامل ژله‌ای تکیه‌گاه فیزیکی را برای رشد کشت‌ها را فراهم می‌آورد. آگار یک پلی ساکارید مرکب با جرم ملکولی بالا است که قدرت تولید ژل در محیط کشت را دارد. این ماده یکی از مشتقات دیواره‌ی سلولی گروهی از جلبک‌های قرمز (رودوفیسه[۸۳]) و علف دریایی گاراسیلاریا[۸۴] است. آگار از دو بخش تشکیل شده است: آگارز[۸۵] ۷۰ درصد و آگاروپکتین[۸۶] ۳۰ درصد. جزئی که باعث ایجاد حالت ژله‌ای در آگار میشود، همان آگارز است. آگار دارای خاصیت جذب آب بوده و وقتی به محیط کشت اضافه میشود، آب آن را جذب نموده و یک حالت ژله‌ای و در عین حال متخلخل به محیط می‌بخشد و در نتیجه تبادل گاز‌ها بخصوص اکسیژن و گاز کربنیک به‌خوبی صورت می‌گیرد. آگار با ترکیبات تشکیل‌دهنده محیط کشت واکنش نداده و همچنین توسط آنزیم‌های گیاه تجزیه نمی‌شود (کینزلی و هندرسون[۸۷]، ۱۹۸۸).
نتایج متعدد نشان داده است که تعداد جنین‌های سوماتیکی تشکیل شده از گل‌آذین نخل خرما به طور قابل توجهی در محیط کشت مایع افزایش یافته است (سیدکی[۸۸]، ۲۰۱۲)، به طوری که ۵/۳ برابر (القرایی، ۲۰۱۲) تا ۵/۵ برابر (عثمانی[۸۹] ۲۰۰۹) بوده است. نتایج مشابه توسط ورمندی و ناوار[۹۰] (۱۹۹۶) در ریزنمونه رأس ساقه به‌دست آمده است. علت آن توزیع بهتر مواد غذایی است زیرا در حالتی که گیاهان غوطه‌ور باشند، به آسانی می‌توانند مواد غذایی، تنظیم‌کننده‌های رشد و مواد دیگر را از تمام جهات جذب نمایند ولی در کشت جامد فقط قسمت انتهایی ریزنمونه در تماس با محیط کشت است. ممکن است برای جنین‌زایی کالوس به دلیل رقابت قابل توجهی برای مواد غذایی مهم باشد (تی‌چت و همکاران[۹۱]، ۱۹۹۱). به‌علاوه، در کشت مایع، مواد مضر تولیدی ریزنمونه‌ها در محیط کشت رقیق می‌گردد، در حالی که در محیط کشت جامد این مواد در نقطه مشخصی متراکم می‌شوند. مقدار آگار بسته به نوع آن و نوع محیط کشت متفاوت است. معمولاً عامل ژل کننده در محیط کشت نخل خرما، آگار و به میزان ۸ گرم در لیتر است (ال‌خلیفه و همکاران[۹۲]، ۲۰۱۲).
۳-۱-۶-۲ کربوهیدات‌ها ( منبع کربن و انرژی)
سلول‌ها، بافتها و اندام‌های گیاهی کشت شده برای تأمین انرژی مورد نیاز خود به یک منبع کربوهیدارت وابسته هستند. در کشت بافت که فعالیت فتوسنتزی در شرایط آزمایشگاهی بافت‌های گیاهی با توجه به شدت نور کم، رطوبت نسبی بالا و محدود بودن تبادل گازی کاهش می‌یابد، تأمین کربوهیدارات ضروری است (کوزای[۹۳]، ۱۹۹۱). در میان کربوهیدات‌های مختلف، بیشتر از ساکارز در کشت بافت استفاده میشود (ایراکی و ترمبلی[۹۴]، ۲۰۰۱). ساکارز معمولاً بعد از اتوکلاو کردن به مونو‌ساکارید‌های گلوکز و فروکتوز تبدیل می‌گردد (فاولر[۹۵]، ۱۹۸۲). بافت‌های گیاهی در حال رشد ابتدا گلوکز محیط را جذب نموده و در ادامه از فروکتوز استفاده می‌کنند. گامبورک و فیلیپس[۹۶] (۱۹۹۵) اظهار داشتند که ساکارز، گلوکز و تا حدودی فروکتوز به عنوان تنها منبع کربن در کشت بافت شناخته شده‌اند. از کربوهیدات‌های دیگری مانند لاکتوز، مالتوز و نشاسته نیز استفاده شده است، اما هیچ کدام بر ساکارز برتری نداشته‌اند (ریکین،۱۹۸۳). ال-باهر[۹۷] (۱۹۸۹) غلظت‌های ۳، ۶ و ۱۰ درصد ساکارز را مورد بررسی قرار داد، او دریافت که بر اساس وزن‌تر کالوس بهترین رشد از ۳ درصد ساکارز به‌دست می‌آید. این نتیجه توسط محمد[۹۸] (۱۹۹۶) نیز به‌دست آمده است. اساکا و همکاران[۹۹] (۱۹۹۴) مشاهده کردند مانیتول از نظر رشد فعال بر حسب درصد وزنی شباهتی به ساکارز نشان نمی‌دهد.
همچنین ساکارز به عنوان بهترین منبع کربن توسط بسیاری از محققان گزارش شده است که احتمالاً ناشی از نقش انتقال انرژی آن در بسیاری از گیاهان است (تامپسون و تورپ[۱۰۰]، ۱۹۷۸). به طوری که الدوایتی[۱۰۱] (۲۰۰۰، به نقل از سیدکی و همکاران، ۲۰۱۲) نشان داد ساکارز نسبت به گلوکز و فروکتوز بهترین نتیجه را در تولید جنین‌های سوماتیکی بالغ از کالوس جنین‌زای ریز نمونه رأس ساقه را داده است. در اغلب گزارشات غلظت در ۶۰ میلی‌گرم در لیتر ساکارز تعداد جنین‌های سوماتیکی نسبت به غلظت ۴۰ میلی‌گرم در لیتر ساکارز کاهش می‌دهد. ابول سعود و همکاران (۲۰۰۷) نیز گزارش کردند که افزایش غلظت ساکارز از ۲۰ تا ۴۰ گرم در لیتر در محیط کشت افزایش درصد جنین‌زایی مستقیم از ریزنمونه گل‌آذین نخل خرما بهبود داده است. ولی افزایش غلظت مانتیول ۳۰ تا ۶۰ گرم تعداد جنین‌های سوماتیکی بالغ از کشت جنین کاهش داده است. از طرفی پدیده‌ی قهوه‌ای شدن کمتر شده است. به طور کلی از مانیتول برای اعمال تنش اسمزی در شرایط آزمایشگاهی در غلظت‌های بالا به محیط کشت اضافه می‌گردد. اعتقاد بر این است مانیتول تقریباً بر فرایند‌های متابولیکی بی‌اثر است، در شرایط آزمایشگاهی پدیده‌های وابسته به مانیتول عمدتاً به عنوان اثرات اسمتیک تعریف می‌گردند (استاینز[۱۰۲]، ۱۹۹۹). ال‌خطیب[۱۰۳] (۲۰۰۸) از شیره‌ی خرما به عنوان یک منبع جایگزین برای ساکارز در محیط کشت استفاده کرده است و نتیجه گرفت که بافت‌های خرما قادر به استفاده از شیره خرما به عنوان تنها منبع کربن برای رشد رویشی خود هستند. علاوه بر این، شیره خرما با غلظت ۶ درصد می‌تواند به عنوان جایگزین ۳۰ تا ۶۰ گرم در لیتر ساکارز بکار رود.
۴-۱-۶-۲ عناصر معدنی
بعد از قند، مواد معدنی مهمترین گروه مواد غذایی در رشد درون شیشه‌ای بافت‌های گیاهی هستند. نمک‌های معدنی عبارتند از عناصر پر‌مصرف[۱۰۴] (نیتروژن، فسفر، پتاسیم، کلسیم و گوگرد) و عناصر کم‌مصرف[۱۰۵] (کلر، مس، منگنز، آهن، روی، مولبیدن و بر). معمولاً از محلول غلیظ پایه[۱۰۶] برای ساختن محیط کشت استفاده میشود. محلول‌های پایه باید در حرارات پایین (۴ درجه سانتی‌گراد) و در شیشه‌های تیره نگهداری شوند. در تهیه محلول‌های پایه ممکن است اضافه کردن نمک‌ها با هم سبب تشکیل رسوب شود که برای جلوگیری از این مشکل بایستی دستورالعمل مربوط به ساخت محلول‌های استاندارد را رعایت کرد (باجوانی و رازادن[۱۰۷]،۱۹۹۶).
۵-۱-۶-۲ اسیدیته (PH)
واکنش pH هر محلول میزان غلظت یون هیدروژن را در آن محلول نشان می‌دهد. pH محیط کشت معمولاً بین ۶/۵ تا ۸/۵ تنظیم می‌گردد، اما عکس‌العمل مطلوب معمولاً در pH متفاوت از آن ایجاد میشود. اگرpH خیلی پایین باشد، ممکن است ۱-پایداری ترکیباتی مثل اکسین (IAA)، اسید جیبرلیک، ویتامین B1 و اسید پانتوتنیک کاهش یابد، ۲-آگار به خوبی سفت نشده و محیط کشت شل و آبکی شود، ۳- برخی نمک‌های خاص (بویژه نمک‌های فسفات و آهن) رسوب کنند ۴- جذب یون آمونیوم کند شود. اتوکلاو کردن pH محیط کشت را کاهش می‌دهد (اسکیروین[۱۰۸] و همکاران، ۱۹۸۶). اغلب، بافت کشت شده خودش حالت بافری را تنظیم می‌کند. به طوری کهpH اندکی کاهش یافته و به حد مطلوب می‌رسد. در نخل خرما بر حسب نوع ریزنمونه pH محیط کشت متفاوت بوده است. به طوری که در کشت ریزنمونه رأس ساقه، گل‌آذین، جنین، pH در حدود ۷/۵ (زاید و همکاران، ۲۰۱۱) و در کشت بساک pH در حدود ۸٫۵ (پرارا، ۲۰۰۷) در نظر گرفته شده است.
۶-۱-۶-۲ هورمون‌ها و تنظیم‌کنندهای رشد
مجموع هورمون‌ها و ترکیبات مصنوعی آنها، تنظیم‌کننده‌های رشد نامیده می‌شوند. در کشت بافت خرما، تنظیم‌کننده‌های رشد (مخصوصاً اکسین‌ها و سیتوکینینها) کاربرد وسیع دارند (جورج و همکاران[۱۰۹]، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۶-۲ اکسین‌ها
تنها اکسین طبیعی مورد استفاده در کشت بافت ایندول استیک اسید (IAA)[110] است. در حالی که اکسین‌های مصنوعی مانند، ایندول‌‌بوتیریک‌‌اسید[۱۱۱]IBA) )، نفتالین‌استیک‌اسید ([۱۱۲](NAA، توفوردی ((۲,۴-D[113]، توفور‌فایو‌‌تی(۲,۴,۵-T)[114]، دیکامبا[۱۱۵] و پیکلورام[۱۱۶] نسبتاً فعال‌تر هستند. اکسین‌ها معمولاً باعث رشد طولی سلول، تورم بافتها، تقسیم سلولی و تشکیل ریشه‌های نابجا، ممانعت از تشکیل شاخه‌های نابجا و جانبی، جنین‌زایی در کشت‌های مایع یا سوسپانسیون، تشکیل مریستم در بافت‌های سازمان نیافته و حفظ غالبیت انتهایی می‌شوند. در غلظت کم اکسین تشکیل ریشه‌های نابجا حالت غالب دارد، در حالی که در غلظت زیاد اکسین تشکیل ریشه صورت نمی‌گیرد و تشکیل کالوس اتفاق می‌افتد. در بعضی موارد اضافه نمودن اکسین سبب تسریع رشد گیاهچه میشود (اسمیت[۱۱۷]، ۲۰۱۲). اکسین‌ها انبساط پذیری دیواره سلولی را افزایش می‌دهند، که منتج به نرم شدن دیواره سلولی و طویل شدن سلول میشود. اکسین‌ها در حضور نور با خروج پروتون از سلول و اسیدی شدن دیواره‌های سلولی، عامل شکستن اتصالات اصلی دیواره ساولی و تحریک توسعه‌ی برگ هستند (ون‌واکن‌برگ و کلاند[۱۱۸]، ۱۹۷۹). اکسین طبیعی (IAA) غالباً به دلیل ناپایدار بودن در کشت بافت درختان به کار نمی‌رود. در زمان تهیه‌ی محیط کشت در حدود ۴۰ درصد IAA موجود در محیط کشت MS با ۲۰ دقیقه اتوکلاو از بین می‌رود (نیسن و ساتر[۱۱۹]، ۱۹۸۸). به‌علاوه وجود آهن در محیط کشت تجزیه‌ی IAA در مجاورت نور را تحریک می‌کند (دانلپ و روباکر[۱۲۰] ۱۹۸۸). IBA در شرایط اتوکلاو و نور با سرعت کمتری نسبت به IAAتجزیه می‌گردد (نسین و ساتر، ۱۹۹۰). یکی دیگر از مزایای کاربرد IBA نسبت به سایر اکسین‌ها این است که IBA به IAA که همان اکسین طبیعی است تبدیل میشود (اپستین و لاوی[۱۲۱]، ۱۹۸۴).
جهت عملکرد بهینه ساختار‌های جنین‌زا در گونه‌های زراعی به اکسین‌های مختلف مورد نیاز است. در میان اکسین‌ها، ۲,۴-D به طور گسترده در کشت بافت خرما مورد استفاده قرار می‌گیرد. به طوری که مؤثرترین اکسین در کشت بافت خرما بوده است. ال حضرمی و بزیز[۱۲۲] (۱۹۹۵) گزارش دادند ۲,۴-D اثرات مفید در القای ظرفیت جنین‌زایی کالوس دارد. دقیقاً مشخص نشده که۲,۴-D چگونه کالوس‌زایی نخل خرما را تقویت می‌کند، اما به دلیل سرکوب تجمع مواد سمی فنلی و همچنین تکمیل کمبود اکسین درون‌زا در کالوس‌زایی مؤثر است (اسمیت و استریت[۱۲۳]، ۱۹۷۴). ابو‌ال‌نیل[۱۲۴] (۱۹۸۹) نشان داد که NAA، IAN[125] و ۲,۴-D ترکیبات فعال در کشت بافت هستند. NAA و IAN در کشت بافت خرما می‌توانند جایگزین ۲,۴-D گردند لذا هر دو تنظیم‌کننده رشد می‌توانند سبب رشد کالوس و باززایی گیاهان شوند. در کشت بافت ارقام نخل خرمای امسکشی[۱۲۶] (سان و همکاران[۱۲۷]، ۲۰۰۶)، جیحل[۱۲۸] و بوستامی‌نویر[۱۲۹] (زوین و ال- هادرامی[۱۳۰]، ۲۰۰۷)، دگلت‌نور[۱۳۱] (افکای و همکاران، ۲۰۰۳) و دگلت‌بی[۱۳۲] (عثمانی و همکاران، ۲۰۰۹) مشخص شد که ۲,۴-D برای القای جنین‌زایی سوماتیکی از ریزنمونه‌ی برگ لازم است اما غلظت ۲,۴-D مورد نیاز ارقام مختلف خرما متفاوت است. ۲,۴-D در بسیاری از سیستم‌های کشت بساک استفاده شده است و غلظت بهینه آن برای القاء آندروژنز به نوع گونه بستگی دارد (بل و همکاران[۱۳۳]، ۱۹۹۳). اکسین مصنوعی ۲,۴-D مؤثرترین تنظیم‌کننده رشد گیاهی برای وادار کردن آندروژنز در بسیاری از محصولات، از جمله جو (ژنگ و کنزاک[۱۳۴]، ۱۹۹۹) و گندم (بال و همکاران، ۱۹۹۳) بوده است. علاوه بر این بر القای کالوس‌زایی در ریزنمونههای مختلف نارگیل (ویراکین[۱۳۵]، ۲۰۰۴؛ ویردیل[۱۳۶]، ۱۹۸۹؛ ایبرت و تیلور،۱۹۹۰) مؤثر بوده است. پرارا و همکاران (۲۰۰۸) نشان دادند که ۱۰۰ میلی‌گرم۲,۴-D برای القای نرزایی در کشت بساک نارگیل مؤثر است. آندروژنز در برخی گونه‌های سخت چوب با اکسین‌های ضعیف‌تر IAAو یا NAA مؤثر‌تر بوده است (چن، ۱۹۸۷). در گندم IAA و NAA ممکن است سبب جنین‌زایی مستقیم شوند در حالی که ۲,۴-D تکثیر سریع سلولی و تشکیل کالوس‌های غیر جنین‌زا را افزایش می‌دهد (بل و همکاران، ۱۹۹۳). مقادیر ppm100-50 از تنظیم کننده‌های رشد IAA،IBA و NAAبر روی پاجوش نخل خرما به طور قابل توجهی تعداد، وزن و طول ریشه را افزایش داده است (ال هدایری و همکاران[۱۳۷]،۱۹۹۱). غلظت‌های بالای NAA (6- ۱۰ تا ۷- ۱۰ مولار ) رشد بافت‌های نخل خرما را تحریک کرده است. اما روی وزن‌تر بافت نارگیل خاصیت باز دارندگی دارد. اما زمانی که از ۶– ۱۰ × ۵/۲ به۵- ۱۰× ۵/۲ آغاز به ریشه‌دهی کرده است (ایوانس، ۱۹۷۸). IAA، IBAو NAA برای ریشه‌زایی پاجوشها استفاده گردیده است (افضل و همکاران[۱۳۸]، ۲۰۱۱). ترم‌زی و همکاران[۱۳۹] (۲۰۱۴) جهت بررسی اثر NAA غلظت‌های مختلف (۰، ۵/۰، ۱ و ۲ میلی‌گرم در لیتر) روی توسعه کشت‌های شبه جنینی از کلون‌هایPL 209 ،PL 213 وPL 220 نخل روغنی بر روی محیط MS مطالعه‌ای انجام دادند. انداز‌ه‌گیری وزن‌تر، پیش‌جنین و تعداد شاخساره‌ها در طول ۱۶ هفته از آزمایش ثبت گردید. نتایج نشان داد که بیشترین میانگین وزن‌تر و تعداد شاخساره در PL 213 در محیط MSبدون NAA (کنترل) و پس از آن درPL 209 وPL 220 رخ داده است. در اکثر آزمایشات انجام شده بر روی نخل خرما NAA برای القاء ریشه و طویل شدن ریشه (خان، ۲۰۱۲)، افزایش توسعه جنین‌های سوماتیک، افزایش کالوس‌های جنین‌زا و تعداد جنین‌های حاصله (پینکر و همکاران[۱۴۰]، ۲۰۱۰) استفاده گردیده است.
۲-۶-۱-۶-۲ سیتوکینینها
سیتوکینینها غالباً برای تحریک رشد و نمو در بافت‌های کشت شده به کار می‌روند. در این میان کینتین، زآتین، بنزیل‌آمین (BA)، دی متیلالیل آمینو‌پورین (۲ip) و بنزیل‌آمینو‌پورین (PBA) استفاده متداولی دارند. زآتین و ۲ip به عنوان سایتوکینین‌های طبیعی شناخته شده‌اند، در حالی که کینتین، BA، PBA سایتوکینین‌های مصنوعی می‌باشند. این هورمون‌ها به‌ویژه اگر توأم با یک اکسین اضافه شوند، باعث تحریک تقسیم سلولی می‌شوند (بوهم[۱۴۱]، ۱۹۸۰). سایتوکینین‌ها در غلظت‌های بالا باعث تشکیل ساقه نابجا می‌شوند، اما معمولاً از تشکیل ریشه ممانعت میشود. این هورمون‌ها از طریق کاهش غالبیت رأسی[۱۴۲] در ریزنمونه باعث تحریک تشکیل ساقه نابجا می‌شوند (اسمیت، ۲۰۱۲). اثر سیتوکینینها بعضی مواقع شبیه اثرات نور است و جذب پتاسیم را تحریک می‌کنند (گرین و مویر[۱۴۳]، ۱۹۷۹). اکسین‌ها در سلول‌ها پدیده‌هایی را تنظیم می‌کنند که منجر به نسخه برداری از DNA میشود. در مقابل سیتوکینینها پدیده‌هایی را تنظیم می‌کنند که موجب تقسیم میتوز میشود. در نتیجه در حضور اکسین نسخه برداری از DNA صورت می‌گیرد، ولی سلول‌ها تقسیم نمی‌شوند، مگر اینکه سیتوکینین هم اضافه شود. به همین دلیل در حضور سیتوکینین، فقط سلول‌هایی تقسیم می‌شوند که قبلاً DNAی آنها نسخه برداری شده است (جوانیو و تاندیو دمارماک[۱۴۴]، ۱۹۷۳). برای تشکیل کالوس و نیز تقسیم سلولی به سیتوکینینها نیاز است (مینوکا[۱۴۵]، ۱۹۸۷)، اما کاربرد سطوح متعادلی از دو تنظیم‌کننده رشد اکسین و سیتوکینین، باعث تشکیل کالوس میشود (روت، ۲۰۰۴). بنزیل‌آمین فعال‌ترین، ارزان‌ترین و تنها سیتوکینینی است که می‌تواند اتوکلاو گردد. بنابراین در کار‌های ریزازدیادی تجاری که هزینه و سادگی کار مورد توجه است بیشترین کاربرد را داراست (توماس و بلاکسلی[۱۴۶]، ۱۹۸۷). گزارشات متعددی وجود دارد که نشان می‌دهد در ترکیب با اکسین بر جنین‌زایی سوماتیکی در تعداد زیادی از گیاهان مؤثر بوده است (جنید و همکاران[۱۴۷]، ۲۰۰۷). اغلب موارد، ۲,۴-D و BAP برای تحریک رشد جنین‌های سوماتیکی استفاده میشود. در نخل خرما ۲/۰ میلی‌گرم در لیتر BAP برای تحریک جوانه‌زنی حدود ۷۶ درصد از جنین‌های سوماتیکی استفاده میشود (هونگ[۱۴۸]، ۱۹۹۹). اشراقی و همکاران[۱۴۹] (۲۰۰۵) نشان دادند که اثر تنظیم کننده‌های رشدی ۲,۴-D و BAP درالقاء کالوس و جنین سوماتیک وابسته به رقم است. در واقع، در رقم خنیزی[۱۵۰] کالوس‌های جنین‌زا بر روی محیط کشت حاوی۶/۴ میلی‌گرم در لیتر BAP و ۴/۳ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-Dتشکیل شده است. درمقابل، در رقم مردار سنگ[۱۵۱] غلظت‌های بالاتر۲,۴-D (154میلی‌گرم در لیتر) برای القاء کالوس‌های جنین‌زا ضروری است.
فرم در حال بارگذاری ...
