وبلاگ

مشخصات

سالم

بیماران پیوند کلیه

تعداد کل
میانگین سن

۲۲۴
۱۴/۱۵±۴۹/۴۰

۲۲۲
۵۴/۱۴±۶۸/۴۱

۲٫۳- وسایل مورد نیاز
وسایل استفاده شده در این پروژه شامل:
سمپلر(Brand, Socorex)، ترازو، میکرو سانتریفیوژ (Hettich)، ورتکس (Scientific industries INC)، اتوکلاو (ریحان طب)، مایکروفر (بوتان)، دستگاه ترموسایکلر (Techne)، Hot plate(Techne)،Rotator (پدیده نوژن پارس)، PH-meter(Metrohm)، Electrophoresis(تانک الکتروفورز و منبع تغذیه جریان الکتریکی پایاپژوهش)، دستگاه Gel documentation(UvitecCambridge).
۳٫۳- محلول­های استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل
محلول­های استفاده شده شامل:
NaOH (50 میلی مولار)، TrisHCl (1 مولار)، محلول NH4Cl (170 میلی مولار)، محلول NaCl-EDTA (10 میلی مولار) می باشد که از طریق روش گفته شده در کتاب Molecular Cloning: A Laboratory Manual تهیه شدند. (Green MR et al, 2012)
۴٫۳– محلول­های استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافی کت
پروتئاز mg/ml 20 (proteinase K)، Lysis Solution، Wash Buffer (Ethanol Base)
Precipitation Solution(Isoprppanole Base)،Solvent Buffer
۵٫۳- مواد لازم جهت انجام PCR
Taq DNA Polymerase (سیناژن)، dNTPs (سیناژن)، MgCl2 (سیناژن)، بافر ۱۰x(10x buffer) مخصوص PCR(سیناژن) و پرایمر های رفت و برگشت ژن CAT و NQO1 (سیناژن)
۶٫۳- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز
بافرTBE، محلول اتیدیوم بروماید (x1000)، Tris Base (سیناژن)، Boric acid (Merck)، EDTA (Merck) 6xloading buffer (سیناژن)، Agarose(Invitrogen)، ۱۰۰bp DNA ladder (Vivantis)
۷٫۳- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده
آنزیم محدود کنندهhinf1 و EcoRV(Fermentas) و بافرEcoRV و بافرv3
۸٫۳-استخراج DNA از خون محیطی
استخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئیات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر می­باشد. (Newton CR et al, 1995)
۹٫۳- استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP
۱- ۵ ماکرولیتر Protease را روی ۱۰۰ ماکرولیتر از نمونه بافی کت ریخته و آن را به مدت ۱۰ ثانیه ورتکس می­کنیم سپس تیوب ها را به مدت ۱۰ دقیقه درون Hot plate 72 درجه سانتیگراد قرار می­دهیم.
۲- بعد از بیرون آوردن تیوب ها از Hot plate 72 درجه، ۴۰۰ ماکرو لیتر Lysis Solution ریخته و به مدت ۲۰- ۱۵ ثانیه ورتکس می­کنیم تا یک سوسپانسیون کاملا هموژن بدست آید بطوری که هیچ لخته یا ماده حل نشدنی درون تیوب­ها مشاهده نشود.
۳- به محلول فوق ۳۰۰ ماکرولیتر از Precepitation Solution اضافه کرده و برای ۵ ثانیه ورتکس می­کنیم، سپس تیوب­ها درون سانترفیوژ با دور g 12000به مدت ۱۰ دقیقه قرار می­دهیم.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۴- بعد از بیرون آوردن از سانترفیوژ محلول رویی تیوب ها را خالی کرده و تیوب ها را روی یک دستمال به مدت ۳-۲ ثانیه قرار می­دهیم.
۵- تیوب ها را برگردانده و به هر کدام ۱ میلی لیتر از Wash Buffer اضافه کرده و به مدت ۵-۳ ثانیه ورتکس کرده و مجددأ درون سانترفیوژ با دورg 12000 این دفعه به مدت ۵ دقیقه قرار می­دهیم.
۶- بعد از اتمام زمان سانترفیوژ مایع رویی را خالی کرده و رسوب ته تیوب را نگه داشته و برای اینکه -Wash Buffer درون تیوب­ها کاملا خشک شود آن ها را به مدت ۵ دقیقه درون Hot plate 65 درجه قرار می­دهیم.
۷- بعد از خشک شدن تیوب­ها آن ها را بیرون آورده و ۳۰ ماکرولیتر از ۸ه اضافه کرده تیوب­ها را به آرامی تکان می­دهیم و مجددأ درون Hot plate 65 درجه قرار می­دهیم به مدت ۵ دقیقه تا رسوب ته تیوب که همان DNA است به خوبی حل شود. DNA بدست آمده را در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری می-کنیم.
۱۰٫۳-PCR^[10]
از واکنش زنجیره­ای پلیمراز جهت تعیین ژنوتیپ­های چند­شکلی ژنتیکی ژن­هایCAT C-262T و NQO1 C609T استفاده کردیم. برای انجام این کار مواد مورد نیازی که در بالا ذکر شد را از فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد بیرون می­آوریم. لازم به ذکر است که آنزیم Tag پلیمراز را در آخر، هنگام اضافه کردن بیرون می­آوریم. بعد از آب شدن مواد در دمای اتاق جهت درست کردن میکس آنزیم آن­ها را روی یخ قرار می-دهیم. کلیه مواد به جزdNTP قبل از استفاده به مدت ۵ ثانیه ورتکس می­کنیم. جهت تهیه ۲۰ ماکرولیتر مخلوط واکنش به ازای هرتیوب، مواد مورد نیاز را طبق جدول ۲٫۳ با هم مخلوط می­کنیم.
جدول ۲٫۳- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR

اجزای واکنش

حجم مورد نیاز به ازای هر واکنش (μl)

۱۰x PCR buffer