وبلاگ

۳-۹ برنامه دمایی PCR
برنامه دمایی واکنش زنجیر ه ای پلیمراز به ترتیب یک مرحله به صورت ۹۴ درجه سانتیگراد ۵ دقیقه، سپس ۳۵ چرخه دمایی به ترتیب : ۹۰ درجه سانتی گراد ۱ دقیقه، ۶۰ درجه سانتیگراد ۱ دقیقه، ۷۲ درجه سانتیگراد ۱ دقیقه و یک مرحله نهایی ۷۲ درجه سانتیگراد ۱۰ دقیقه باشد.
۳-۱۰ الکتروفورز ژل آگارز
۳-۱۰-۱مواد لازم الکتروفورز ژل آگاروز۲%
پودرآگاروز، اتیدیوم‌برماید، بافر نمونه DNA (DNA loading Buffer 6X)، بافر الکتروفورز TBE
۳-۱۰-۲ طرز تهیه ژل آگارز ۲%
پودر آگاروز شرکت Fermentase 1 گرم
بافر TBE 1X 50 میلی‌لیتر
اتیدیوم‌ ‌برماید شرکت تکنوژن ایران ۵ میکرولیتر
پس از توزین پودر آگاروز آنرا در یک ارلن ریخته و۵۰ میلی‌لیتر بافر TBE 1X به آن اضافه نموده و سپس مخلوط بافر و آگاروز را حرارت داده تا شفاف شود. پس از آن اجازه داده شد که محتویات ارلن کمی سرد شود و نهایتاً ۵ میکرولیتر اتیدیوم ‌برماید افزوده شد.
ژل را در داخل قالب ریخته و پس از سرد شدن، با بافر TBE1X و جریان ۱۴۰ولت نمونه ها الکتروفورز شد.
پس از اتمام الکتروفورز، باندهای حاصل از قطعات تکثیر شده در دستگاه Gel Document تحت نور فرابنفش قابل رویت و عکس برداری شده. سپس تجزیه و تحلیل باندها انجام گرفت.
۳-۱۰-۳طرز تهیه بافر TBE 1X
مواد مورد نیاز برای ساخت این بافر به شرح زیر است:

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

Tris base: 10.9 gr
Boric acid: 5.56 gr
EDTA: 7.74 gr
ترکیبات فوق را پس از توزین، در ۸۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر با هم مخلوط کرده و پس از تنظیم ۸pH=، حجم به ۱ لیتر رسید.
۳-۱۰-۴طرز تهیه اتیدیوم‌برماید
مقدار ۱۰ میلی‌گرم از اتیدیوم‌برماید را وزن نموده و در ۲۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل شود. به هنگام استفاده ۵ میکرولیتر از محلول فوق را در ژل با حجم ۵۰ میلی‌لیتر بکار برده، بنابراین غلظت اتیدیوم‌برماید در ژل با حجم ۵۰ میلی‌لیتر، معادلg/ml µ ۵/۰ است.
در هنگام کار با ماده اتیدیوم‌برماید باید توجه داشت که این ماده سمّی بوده و به شدت سرطان‌زاست. بنابراین باید احتیاط‌های لازم جهت استفاده از ماسک و دستکش به عمل آید.
۳-۱۱ هضم آنزیمی
نمونه­هایی که در مرحله الکتروفورز بهترین باندها را داشتند انتخاب کرده و بر روی آنها هضم آنزیمی انجام داده شد. برای هضم آنزیمی از آنزیم برشی Bsu36I استفاده شد.
این آنزیم در ژن TGF-B1 با هضم قطعه ۸۰۸ جفت بازی از این ژن دو قطعه با اندازه­ های ۶۱۷ و ۱۹۱ جفت بازی تولید می­ کند (آلل C). درصورت مشاهده باند ۸۰۸ جفت بازی آلل T بدست خواهد آمد. مواد لازم برای واکنش هضم توسط آنزیم برشی Bsu36I در جدول ۳-۳ شرح داده شده است. به ازای هر نمونه از ۲/۰ میکرولیتر آنزیم برشی استفاده می­ شود. پس از اضافه کردن آنزیم به نمونه­های مورد نظر که از واکنش PCR مرحله قبل انتخاب شده بودند، به مدت ۴ ساعت و دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در دستگاه ترموسایکلرقرار داده شدند. پس از اتمام ۴ ساعت نمونه­ها را بر روی ژل آگارز ۲درصد طبق مرحله قبل بارگذاری کرده و جمعیتهای مورد نظر از نظر وجود یا عدم وجود ژن غربال شدند.
جدول ۳-۳ مواد و مقادیر لازم برای واکنش هضم آنزیمی یک نمونه

نام ماده

مقدار

PCR reaction mixture
۱۰ میکرولیتر
Bsu36I
۱-۲ میکرولیتر
Nucleas free water
۱۸ میکرولیتر

۳-۱۲ روش تجزیه و تحلیل داده ها :