وبلاگ

کلیه مواد شیمیایی و حلال­های مورد استفاده در این پژوهش:
دی متیل سولفوکساید^[۴۱]، متانول، مولر هینتون آگار^[۴۲]، مولر هینتون براث^[۴۳]، نوترینت براث^[۴۴]، نوترینت آگار^[۴۵]، نیتروبلو تترازولیوم کلراید^[۴۶] از شرکت مرک^[۴۷] و اسیدآسکوربیک، فریک کلراید، تری کلرو استیک­اسید، پتاسیم فری­سیانید، بافر فسفات، دی­فنیل پیکریل هیدرازیل، اسیدگالیک، کربنات سدیم، یدید پتاسیم، فولین-سیوکالتیو، ید، سود، فنیل فتالئین، روی، اسید کلریدریک، آمونیاک، سدیم کلراید، کلروفریک، اتیل­اتر با درجه خلوص بالا تهیه شد.
دستگاه­های مورد استفاده در این پژوهش:
اسپکتروفتومتر، انکوباتور، آسیاب برقی، روتاری، شیکر، هود لامینارفلو، ورتکس، یخچال، اتوکلاو، ترازو دیجیتال آزمایشگاهی، ترازو دیجیتال با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم، سانتریفیوژ، بن­ماری، آون و PH متر بود.
۲-۲ تهیه گیاهان مورد بررسی و تعیین نام علمی آن­ها
گیاهان مورد مطالعه در این پژوهش: بادام کوهی (Amygdalus scoparia)، بومادران (Achillea millefolium)، کلپوره (Teucrium polium)، گلپر (Heracleum persicum) و مریم­گلی (Salvia officinalis).
تعیین نام علمی: این مرحله بسیار حساس بوده و لزوما باید توسط شخص مجرب و متخصص صورت گیرد. جهت تعیین نام علمی نیاز به وجود یک یا چند نمونه از گیاه می باشد. گیاه شناس ابتدا به تشخیص راسته، تیره و سپس جنس گیاه پرداخته که در صورت وجود نمونه کامل و مناسب تا این مرحله شناسایی سریعا انجام می گیرد. تعیین گونه و احیانا واریته دقت زیادی را می طلبد و به کمک کتب مرجع، مقایسه با دیگر نمونه های هرباریومی و بررسی میکروسکوپی و غیره صورت می گیرد. پس از شناسایی نام علمی توسط متخصصین گیاه­شناس، نمونه­ها به آزمایشگاه فیزیولوژی برای آزمایش­های میکروبی منتقل شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

آسیاب کردن: بخش­های مورد استفاده خشک­شده این گیاهان جهت تهیه عصاره، به وسیله آسیاب برقی خرد شده و با بهره گرفتن از الک به صورت پودر درآمدند تا سطح تماس بیشتری با حلال داشته باشند.
۲-۳ استخراج عصاره متانولی
پودر ۱۰۰ گرم از بخش­های مختلف رویشی و زایشی گیاهان مورد بررسی، در ۵۰۰ میلی­لیتر متانول ۸۰% به مدّت ۴۸ ساعت روی دستگاه شیکر (مخلوط را یکنواخت می­گرداند) در دمای ۴۰-۳۷ درجه سانتی ­گراد با دور ۲۷۰ در دقیقه به روش ماسراسیون، عصاره­گیری شدند. دلیل استفاده از خیساندن، عدم آسیب مواد موجود در عصاره تهیه شده از گیاهان بوده است [۷۸]. در طول این فرایند سعی شد تا با هم­زدن، عصاره یکنواختی حاصل شود [۷۹]. عصاره حاصل با کاغذ واتمن ۴/۰ میکرونی صاف گردید. بقایای گیاهی مجددا با متانول به مدت ۲۴ ساعت دیگر با همان شرایط قبلی تحت عملیات استخراج قرار گرفت و محلول صاف شده به عصاره اولیه اضافه شد. عصاره متانولی تحت شرایط خلاء در دمای ۵۰ درجه سانتی ­گراد با دور ۸ در دقیقه توسط دستگاه روتاری^[۴۸] تغلیظ و در پتری­ دیش­های استریل ریخته و در دمای ۵۰ درجه سانتی ­گراد آون خشک گردید [۸۰]. عصاره­ها پس از سپری­شدن ۴ روز به صورت خشک با نسبت وزنی متفاوت از گیاهان مختلف تهیه شدند.
۲-۴ روش تهیه محیط­های کشت
محیط کشت جامد مولر هینتون آگار:(۶٫۸ g/ 200 ml) 34 g/ l
محیط کشت مایع مولر هینتون براث: (۲٫۱ g/ 100 ml) 21 g/ l
محیط کشت نوترینت آگار: ۵۲ g/ l
محیط کشت نوترینت براث: ۳۷ g/ l
مقدار معینی از محیط کشت را با آب مقطر استریل به حجم رسانیده و پس از سترون­کردن با اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد جهت ادامه کار مورد استفاده قرار می­دهیم.
۲-۵ استریلیزاسیون محیط­های کشت میکروبی، ظروف و مواد مصرفی
تمامی وسایل و مواد مورد نیازی که قبل از استفاده، نیاز به سترون­شدن دارند از جمله: فالکن، میکروتیوب، لوله­های آزمایش، سرسمپلر و محیط­های کشت جامد و مایع قبل از تلقیح باکتری به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی ­گراد اتوکلاو شدند. محلول­های ذخیره نمک­های فلزات و حلال­های آلی به­ این دلیل که سترون­سازی از طریق اتوکلاو می ­تواند منجر به تغییر ساختار نمک و یا تبخیر حلال شود، به وسیله فیلتر ۲/۰ میکرونی استریل شدند.
۲-۶ احیاء باکتری
قبل از هر آزمون میکروبی، زیر هود لامینارفلو قسمت­ های سطحی هود با پنبه آغشته به الکل ۷۰% استریل و به مدت ۲۰ دقیقه تحت اشعه UV قرار گرفت. آمپول لیوفیلیزه حاوی میکروارگانیسم­های مورد مطالعه را در شرایط استریل شکسته و با حدود ۲-۱ میلی­لیتر محیط کشت نوترینت براث به صورت سوسپانسیون درآمد. چند قطره از این سوسپانسیون توسط سرنگ استریل به محیط کشت جامد نوترینت آگار منتقل گردید تا بعد از رشد ۲۴-۱۸ ساعته در گرمخانه دما به عنوان کشت ذخیره^[۴۹] از آن استفاده گردد.
۲-۷ تهیه کشت تازه (در فاز لگاریتمی) از میکروارگانیسم­ها
هر یک از سویه­های باکتریایی یک روز قبل از انجام آزمون میکروبی بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار ذکر شده، کشت سطحی داده شدند تا میکروارگانیسم­ها پس از یک شب انکوباسیون در هنگام تهیه سوسپانسیون میکروبی در فاز لگاریتمی قرار داشته باشند.
۲-۸ تهیه استاندارد نیم مک­فارلند^[۵۰]
۵/۰ میلی­لیتر از کلرید باریم^[۵۱] ۱۷۵/۱% با ۵/۹ میلی­لیتر اسید سولفوریک ۱% را داخل لوله آزمایش استریل درب­دار اضافه و توسط دستگاه ورتکس هم زده شد. تعداد تقریبی باکتری­ ها ۱۵۰۰ میلیون در میلی­لیتر است. این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظروف درب­بسته می ­تواند مورد استفاده قرار گیرد اما با این اوصاف، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود.
۲-۹ تهیه سوسپانسیون میکروبی
به وسیله لوپ از کلنی هرکدام از باکتری­ ها برداشته و در یک لوله آزمایش استریل حاوی ۹ میلی­لیتر سرم فیزیولوژی استریل (یا محلول نمکی NaCl 8.5 g/ l) کاملا مخلوط کرده به طوری که سوسپانسیون کاملا یکنواختی از باکتری مورد آزمایش به­دست آید. سپس جذب نوری این سوسپانسیون در طول موج ۶۲۵ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، در مقابل بلانک خوانده می­ شود تا کدورتی معادل استاندارد ۵/۰ مک فارلند ۱۰^۸ ×۵/۱ داشته باشد.
۲-۱۰ آزمون­های میکروبی
۲-۱۰-۱ تست دیسک دیفیوژن
حساسیت میکروارگانیسم­های بیمارستانی به عصاره­ها با بهره گرفتن از روش نفوذ انتشاری^[۵۲] بررسی گردید. جهت انجام این آزمایش، مقدار مشخصی از عصاره­های خشک گیاهی در حلال DMSO استریل شده، حل و سپس غلظت­های ۱۰۰۰، ۷۵۰، ۵۰۰، ۲۵۰ و ۱۲۵ میلی­گرم بر میلی­لیتر تهیه شدند. در روش کیفی نفوذ انتشاری از روش بائر کربی^[۵۳] استفاده شد [۸۱]. ۱۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی روی سطح محیط کشت مولر هینتون آگار چکانده شد و با یک سوآپ کتان استریل روی محیط گسترش یافت. دیسک­های خام استریل به قطر ۶ میلی­متر توسط پنس استریل روی سطح محیط کشت در زیر دستگاه لامینارفلو به فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت قرار داده شد و ۲۰ میکرولیتر از محلول عصاره­ها با غلظت­های مشخص روی دیسک­ها چکانده شد. در این آزمایش دیسک حاوی آنتی­بیوتیک­های مورد مطالعه به عنوان شاهد مثبت و دیسک­های حاوی DMSO به عنوان شاهد منفی استفاده شد. پلیت­ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد انکوبه شدند [۸۲]. از آن جایی که عصاره­ها دارای رنگ بودند، با توجه به انتشار رنگ در محیط توانستیم انتشار عصاره را نیز ردیابی کنیم. اندازه ­گیری قطر هاله عدم رشد زیر نظر کارشناس متخصص آزمایشگاه و در شرایط آسپتیک با بهره گرفتن از خط­کش ثبت شد.

شکل ۲-۱: اندازه ­گیری قطر هاله عدم رشد با خط­کش میلی­متری
برای حصول اطمینان، این آزمایش برای هر سویه باکتری سه بار تکرار گردید و میانگین قطر هاله عدم رشد به عنوان قطر نهایی ثبت شد. قطر هاله عدم رشد کمتر از ۷ به عنوان مقاوم، ۹-۷ نسبتا مقاوم، ۱۲-۱۰ نسبتا حسّاس و بیشتر از ۱۲ میلی­متر به عنوان حسّاس در نظر گرفته شد شکل (۲-۱) [۸۳].
۲-۱۰-۲ تست آنتی­بیوگرام
به دلیل عدم وجود یک استاندارد خاص در مورد میزان استفاده از عصاره گیاهی از دیسک­های آنتی­بیوتیکی به عنوان یک استاندارد و شاهد استفاده شد. جهت بررسی حساسیت سویه­ها به آنتی­بیوتیک­های استاندارد مورد مطالعه، ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده را به روش سطحی روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده و سپس دیسک­های آنتی­بیوتیک را در فاصله­های معین روی محیط قرار داده و پلیت­ها به مدت ۲۴ ساعت جهت بررسی هاله عدم رشد در شرایط میکروآئروفیلیک گرمخانه­گذاری شدند [۸۷-۸۴]. با اندازه ­گیری قطر هاله عدم رشد به سادگی می­توان حساسیت باکتری­ ها نسبت به آنتی­بیوتیک را تعیین نمود. تست آنتی­بیوگرام با مقاوم^[۵۴]، نیمه­حساس^[۵۵] و حساس^[۵۶] گزارش می­ شود.
۲-۱۰-۳ تعیین حداقل غلظت بازدارندگی^[۵۷]و حداقل غلظت کشندگی^[۵۸]
جهت انجام آزمایش­های کمی برای حداقل غلظت بازدارندگی از رشد میکروارگانیسم [۸۸] و حداقل غلظت کشندگی میکروارگانیسم [۸۹] از روش رقت لوله­ای^[۵۹] استفاده شد.
MIC: غلظتی از یک عصاره است که می ­تواند از رشد باکتری در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کند.
MBC: کمترین غلظتی از عصاره که می ­تواند سبب نابودی بیشترین تعداد باکتری (۹/۹۹%) شود.
۲-۱۰-۳-۱ تعیین MIC عصاره
برای تعیین MIC با روش رقت لوله­ای از یک سری لوله­های آزمایش ۱۰ تایی استفاده شد. ۷ لوله برای غلظت­های مختلف هر عصاره گیاهی و یک لوله به عنوان کنترل مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی و DMSO فاقد عصاره)، یک لوله به عنوان کنترل مثبت مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی فاقد عصاره) و یک لوله به عنوان کنترل منفی (دارای محیط کشت و عصاره بدون سوسپانسیون میکروبی) در نظر گرفته شد.
به­ هر کدام از لوله­ها cc1 محیط کشت مولر هینتون براث اضافه و به لوله اول cc1 عصاره استوک با غلظت ۱۰۰۰ میلی­گرم بر میلی­لیتر اضافه گردید. پس از مخلوط کردن، cc1 از لوله اول به لوله دوم و سپس cc1 از لوله دوم به لوله سوم، به­همین ترتیب تا لوله هشتم انجام شد و سرانجام cc1 از آن به بیرون ریخته شد. به تمامی لوله­ها ۵۰ میکرولیتر از هر سوسپانسیون میکروبی اضافه گردید [۹۰، ۹۱]. به این ترتیب غلظت عصاره در لوله­های ۱ تا ۸: ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶۲/۱۵، ۸/۷ و ۹/۳ میلی­گرم بر میلی­لیتر بود. تمامی لوله­ها به مدّت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرار گرفتند. پس از گذشت مدت زمان لازم پلیت­ها از گرمخانه خارج و جهت تعیین MIC مورد بررسی قرار می­گیرند.
برای تعیین MIC عصاره­ها از محلول ۵ میلی­گرم بر میلی­لیتر نیتروبلو تترازولیوم کلراید، مقدار ۵۰ میکرولیتر در تمام لوله­های آزمایش ریخته و مجددا به مدت ۳ ساعت در گرمخانه انکوبه می­شوند. یک غلظت بالاتر از آخرین غلظتی که رنگ بنفش تترازولیوم را به خود گرفته، به عنوان MIC عصاره برای میکروب مورد نظر، در نظر گرفته می­ شود [۹۲].
۲-۱۰-۳-۲ تعیین MBC عصاره­
به منظور تعیین MBC عصاره از هر کدام از لوله­های آزمایش که رنگ بنفش نگرفته­اند ۵ میکرولیتر بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده می­ شود سپس پلیت­ها به مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه ۳۷ درجه قرار داده می­شوند. پس از گذشت زمان لازم پلیت­ها از گرمخانه خارج و نتایج آن بررسی می­ شود. غلظتی که در آن رشدی دیده نشود، به عنوان MBC عصاره برای میکروب مورد نظر گرفته می­ شود [۹۳].
۲-۱۱ بررسی خواص فیتوشیمیایی اولیه
برای انجام این آزمایشات غلظت­های ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلی­گرم برمیلی­لیتر از عصاره خشک گیاهان مورد مطالعه به منظور بررسی وجود آلکالوئید، تانن، ساپونین و آنتوسیانین به شرح ذیل به کار گرفته شد.
۲-۱۱-۱ آلکالوئید
۲۵۰ میلی­لیتر از غلظت­های مختلف عصاره گیاهان تهیه و ۵ میلی­لیتر اسید کلریدریک ۱% به آنها اضافه و به مدت ۵ دقیقه جوشانده و سپس حجم به میزان اولیه رسانده شد و محلول اسیدی حاصل با کاغذ صافی، صاف گردید. محلول حاصل توسط مقدار مناسب آمونیاک ۱۰% قلیایی و با اتیل اتر استخراج گردید. محلول اتری تا حد خشک تبخیر و به آن ۵ میلی­لیتر اسید­کلرید­ریک ۱% افزوده شد. سپس محلول اسیدی حاصل به ۳ قسمت تقسیم گردید. ۱ قسمت به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و به ۲ قسمت دیگر معرف بوشاردا و مایر اضافه گردید. تشکیل رسوب سفید مایل به زرد با افزایش معرف مایر و تشکیل رسوب قهوه­ای رنگ با افزودن معرف بوشاردا نشان دهنده­ آلکالوئید است [۹۴، ۹۵].
۲-۱۱-۱-۱- معرف مایر
۲۰ گرم سود را داخل ۲۰۰ سی­سی آب مقطر حل کرده و ۱ گرم فنیل فتالئین به آن اضافه می­کنیم تا یک محلول ارغوانی به دست آید. سپس ۲۰ گرم پودر روی را به آن می­افزائیم و هم می­زنیم تا کاملا حل شود. بعد محتویات را حرارت می­دهیم. برای اینکه آب آن تبخیر نشود، یک بشر را وارونه روی ظرف حاوی محلول می­گذاریم تا بخار به داخل ظرف برگردد. محلول را تا زمانی حرارت می­دهیم که رنگ ارغوانی از بین برود و مایع شفاف شود. این محلول را پس از سرد شدن می­توان در شیشۀ قهوه­ای رنگ داخل یخچال نگهداری می­کنیم و هم­چنین به عنوان نگهدارنده می­توان مقداری پودر روی، داخل شیشه بریزیم.