۴
محصول PCR
۱
آب مقطر
۴
پرایمر (فوروارد یا ریورس)
۱
حجم نهایی
۱۰
* کیت توالییابی شامل بافر PCR، dNTP برچسب دار و آنزیم تک پلیمراز است.
شکل ۲-۱۱ دستگاه ABI3100 برای توالی یابی محصولات PCR و آنالیز ژنتیکی
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
شکل ۲-۱۲ نمونه ای از کروماتوگرام نمونههای توالییابی شده در این آزمایش
پس از انجام مراحل فوق و آزمون کارآئی پرایمرها در تعداد محدودی ژنوتیپ، اطمینان حاصل گردید که پرایمرهای طراحی شده در این مطالعه (برای دو ژن CBL4 و vHKT1) از قابلیت بالایی برای بررسی تنوع تک نوکلئوتیدی در بقیه ژنوتیپها نیز برخوردارند. نتایج مرحله اول آزمایش در مقیاس کوچک علاوه بر نشان دادن قابلیت بالای پرایمرها، کارائی و دقت بسیار زیاد روش توالییابی در مقایسه با روشهای رایج دیگر برای مطالعه پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی را نیز نشان داده است. ضمن آنکه با بهره گرفتن از این روش و بهرهمندی از ابزار و تکنولوژیهای قوی توالییابی در حال حاضر در زمان و هزینه مورد نیاز برای چنین مطالعاتی نیز صرفه جوئی میگردد. بنابراین، کلیه نمونههای گیاهی (۹۶ ژنوتیپ) در این آزمایش با روش توالییابی مورد بررسی و آنالیز ژنتیکی قرار گرفتند.
۲-۱۱ آنالیز ژنتیکی داده های توالییابی
آنالیز داده های توالییابی با بهره گرفتن از نرمافزارهای CodonCodeAligner، DNASTAR و HaploSNPer انجام گرفته است. از نرمافزارهای DNASTAR و CodonCodeAligner برای ترکیب توالیها و یافتن انواع موتاسیونهای تک نوکلئوتیدی، رسم درخت فیلوژنی و نقشههای هضم آنزیمی استفاده گردید (Kapustin et al., 2008). جستجو و تشخیص گروه های هاپلوتیپی به کمک نرمافزار HaploSNPer انجام گرفت.
فصل سوم- نتایج و بحث
تشخیص و تعیین تعداد، انواع و محل وقوع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در دو ژن مورد مطالعه در این تحقیق (HKT1 و CBL4) به کمک آنالیز نتایج توالییابی قطعات تکثیری این ژنها انجام گرفته است. این آنالیز به دو شکل صورت گرفته است. در حالت اول، توالی نوکلئوتیدی چهار قطعه هم پوشان حاصل از تکثیر چهار پرایمر از هر ژن در هر ژنوتیپ به کمک نرم افزار CodonCode Aligner با یکدیگر ترکیب شده و یک قطعه ترکیبی[۷] که شامل توالی کامل بخش بیان شده این ژن بود، به دست آمد. پس از آن، این قطعات ترکیبی در ۹۶ ژنوتیپ مورد مطالعه با توالی بیان شده ژن در رقم شاهد که از آن برای طراحی پرایمر استفاده گردید مقایسه شدند. این مقایسه نیز به کمک نرم افزار CodonCode Aligner انجام گرفته است. در حالت دوم، توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیر شده توسط هر پرایمر در ۹۶ ژنوتیپ آزمایشی همراه با قطعه مربوط در شاهد به کمک نرم افزار فوق با یکدیگر مقایسه گردیدند. این نرم افزار با مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژنوتیپهای مختلف و شاهد، انواع موتاسیونها شامل حذف و اضافه نوکلئوتیدی، جابجائیهای نوکلئوتیدی، همچنین هموزیگوت و یا هتروزیگوت بودن موتاسیون و محل وقوع آنها را مشخص نموده است.
۳- ۱ آنالیز قطعه کامل ژن HKT1
توالی ژنومی قطعه مورد نظر ژن HKT1، که به عنوان یکی از ژنهای متحمل به شوری در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته است، به طول bp 1925 بوده که قسمت بیان شده آن (بخش رنگی) به طول bp 1540 و به صورت یک کانتیگ یکپارچه از مناطق اگزونی میباشد (شکل ۳- ۱). قطعه ژنومی کامل بیان شده ژن HKT در کلیه ژنوتیپهای آزمایشی تکثیر شده و سپس توالییابی گردید و به کمک نرم افزار CodonCode Aligner با شاهد مقایسه شده است. نتایج این آنالیز در جدول ۳- ۱ ارائه گردیده است. در این جدول، تعداد کل بازها (نوکلئوتیدها)ی متعلق به قطعه ژنی مورد نظر در ۹۶ ژنوتیپ آزمایشی ۲۲۴۲۵۸ باز گزارش شده است که با مقایسه آنها با یکدیگر مشخص گردید ۴۰۲۱ باز از آن نسبت به شاهد تغییر یافته و موتانت شده اند. این تعداد تغییرات در ۱۵۷۵ مکان ژنی اتفاق افتاده است. با مقایسه تعداد بازهای موتانت و تعداد مکانهای ژنی که در آن موتاسیون رخ داده میتوان نتیجه گیری نمود که در یک مکان ژنی، بیش از یک نوع موتاسیون در ژنوتیپهای مختلف به وقوع پیوسته است. مطابق نتایج جدول فوق در ۱۶۷ مورد، وقوع موتاسیون موجب قرار گیری دو نوکلئوتید متفاوت در مجاورت هم گردیده که اصطلاحاً گفته می شود موتاسیون نوع هتروزیگوس اتفاق افتاده است. در ۲۵۵۴ مورد، عکس حالت قبل رخ داده و قرارگیری دو نوکلئوتید مشابه در مجاورت یکدیگر موجب ایجاد موتاسیون نوع هموزیگوس شده است. تعداد ۳۵۵ موتاسیون از مجموع ۲۵۵۴ موتاسیون هموزیگوس در منطقه کد کننده ژن قرار گرفته است.
۱ tcgcactcat atatagcacc atgggttggg tgaaaagatt ttaccaagat ttcatccata
۶۱ tcaagctgca tagcttttgc cgtatcagta gatatgttgt cgattcaata gcttttgtct
۱۲۱ atcgatttgt tgcattgcat gttcacccct tctggatcca actgtcctac ttccttgcca
۱۸۱ ttgctatact tggttcagtc ctcttgatgt cgctgaaacc aagcaacccc gacttcagcc
۲۴۱ ctccttacat tgacatgtta ttcttgtcaa cttctgctct aacagtttct ggcctcagca
۳۰۱ ccatcacgat ggaggacctc tcaagcgctc aaattgtggt cttgacactg ctcatgcttg
۳۶۱ taggagggga gatctttgtt tcactcttag ggctcatgct tagagtgaac catcaagaca
۴۲۱ tgccagatct tccaagagtg aagatcagct cagttcctgt cgagcttgaa gagatagact
۴۸۱ tggccaacag catggcactc tctgatgagt cacagcttga agaagcaact catgcaatta
۵۴۱ cacccaagaa atgtacaggg ttgaagagga gtaggtctgt caagtgctta ggatatgtgg
۶۰۱ tctttgggta ctttgccgtg atccatatct tgggctttct gctggttttt ctgtatataa
۶۶۱ ctcgtgtgcc aactgcaagt gcaccactca acaagaaagg gatcaacatt gtgctcttct
۷۲۱ cattatcggt taccgtcgcc tccattgcaa atggaggact cgtgccgacg aatgagaaca
۷۸۱ tggtcatctt ctcaaagaat tcaggcctct tgctgctgct cagtggtcag attttggcag
۸۴۱ gcaacttatt gttccctctc ttccttaggt tactggtatg gttcctgggg aggctcacaa
۹۰۱ aggtgaagga gctgcggctc atgatcaaga atccagagga agtgcatttt ggtaatctgc
۹۶۱ ttcctaggtt gccgactgtg tttctctcct cgacagccat tggccttgta gcagctgggg
۱۰۲۱ tcacaatgtt ctccgctgtt gattggaatt cttccgtgtt tgatggcctc agctcttatc
۱۰۸۱ agaaggctgt caatgcattc ttcatggtgg tgaatgcaag gcactcaggg gagaattcca
۱۱۴۱ tcgactgctc actcatgtca cccgccatta tagtactatt cattgtcatg atgtatttgc
فرم در حال بارگذاری ...
