وبلاگ

۱

۴ min

۹۵°C

Initial denaturation

۳۰

۴۰ sec
۳۰ sec
۴۰ sec

۹۴°C
? °C
۷۲°C

Denaturation
Annealing
Extension

۱

۲ min

۷۲°C

Final extension

Hold

۴°C

Hold

۳-۷-۵ الکتروفورز
از آنجائیکه ماکرومولکولهای زیستی باردار هستند، می توان با قرار دادن آن ها در یک میدان الکتریکی ا براساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی آن ها را تفکیک کرد. بدین منظور از روش الکتروفورز استفاده می شود.
۳-۷-۵-۱ الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید (PAGE)
از جمله قابلیت ژل پلی اکریل آمید توانایی تفکیک بالای قطعات DNA در آن است و قادر است قطعات DNA را با ۲/۰ درصد اختلاف (یک نوکلئوتید در ۵۰۰ نوکلئوتید) از یکدیگر جدا نماید.
در این ژل ماده اکریل آمید به صورت ذرات مونومر می باشد. این ذرات می توانند با اتصال به یکدیگر زنجیره های بلندی را ایجاد نمایند، حال چنانچه ترکیبی مثل بیس اکریل آمید را به آن اضافه کنیم این ترکیب به صورت رشته های عمودی بین رشته های بلند قرار می گیرد و با تشکیل اتصالات عرضی باعث شکل گیری ژل می شود. بستن این ژل واکنشی شیمیایی است و نیاز به کاتالیزور دارد. کاتالیزور این واکنش APS (آمونیوم پرسولفات) و TEMED (Tetramethylethylendiamine) می باشد.
ژل پلی اکریل امید به صورت عمودی در تانک مخصوص خود قرار می گیرد. بافر مورد استفاده آن TBE 1x(Tris/Borate/EDTA ) می باشد که در تهیه ژل و در الکتروفورز مورد استفاده قرار می گیرد.
بافر جهت لودکردن محصولات PCR در ژل پلی اکریل آمید زایلون وسیانول-بروموفنل آبی است. ما در اینجا نیاز به ژل پلی اکریل آمید ۸% داریم که برای قطعاتی با طول ۵۰ تا ۴۰۰ bpاستفاده می شود.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

در این ژل دو رنگ بروموفنل آبی و گزیلن سیانول (موجود در بافرloading dye ) با سرعت مشخصی در ژل که مطابق با اندازه قطعه DNA معین می باشد حرکت می کنند. در ژل پلی اکریل آمید سرعت حرکت قطعات DNA تنها به طول قطعه بستگی نداشته، بلکه توالی قطعه نیز بر میزان حرکت اثر می گذارد، به عنوان مثال توالی غنی از AT کندتر از بقیه توالی ها حرکت می کند. به این دلیل هیچگاه از ژل پلی اکریل آمید برای تعیین اندازه یک قطعه نامشخص استفاده نمی کنند.
۳-۷-۵-۲ مواد لازم جهت الکتروفورز ژل پلی اکریل امید
محلول پلی اکریل امید۳۰ درصد
پودر پلی اکریل امید gr 29
Bis gr 1
آب مقطر دیونیزه ml100
۲۹ گرم از پلی اکریل آمید را وزن کرده به ۱ گرم Bis اضافه کرده و حجم محلول را با آب مقطر دیونیزه به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.